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单克隆抗体的融合过程

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　　单克隆抗体融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1*为常用。
　　1．试剂与材料
　　(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
　　(2)1640培养液100ml。
　　(3)完全1640液100ml。
　　(4)2.5%FCS－1640液50ml。
　　(5)HAT培养液100ml。
　　(6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压**，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。
　　(7)10ml和50ml的**沉淀管或瓶。
　　(8)40孔塑料培养盘。
　　2．操作方法
　　⑴准备好脾细胞。
　　⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。
　　⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。
　　⑷移去上清液。
　　⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。
　　⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。
　　⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。
　　⑻重复⑺一次。
　　⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。
　　⑽重复⑼一次。
　　⑾加1640液15ml。
　　⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。
　　⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
　　⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。
　　⒂轻摇后，放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。
　　⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。
　　⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。
　　⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。
　　（三）细胞融合的关键
　　1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者**细胞没有查到**应答。这必然要失败的。
　　2．融合试验*大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。

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