浅析 气相色谱法 (GC)测定大豆中低聚糖含量
(一) 方法原理
用GC对糖进行定量时, 对分子量大的四碳糖、五碳糖的衍生物必须选用在高温下稳定的固定液。本法给定的TMS化条件为: 在室温下, 五碳糖完全TMS化后, 至少要在7小时内保持稳定。使用不锈钢柱, 固定液用2% Silicone OV-17(担体Chromosorb W(AW, DMCS)], 采用10℃/min的程序升温分析, 进样口温度高达350℃各种低聚糖分离效果良好。方法适用于含有蔗糖、棉子糖、水苏糖等低聚糖的大豆、小豆、豌豆制品及一般农产食品。
(二) 仪器、试剂
1 仪器 气相色谱仪: 带有火焰电离检测器(FID);柱子: 2根3mm×0.5m的不锈钢柱;旋转式汽化器: 使用25ml圆底烧瓶;微量注射器。
2 试剂 糖标准品: 蔗糖、棉子糖、水苏糖;吡啶: 用氢氧化钾干燥后蒸馏;芘: 作内标物用;六甲基二硅胺烷(hexamethyl disilazan , HMDS);三氟乙酸(TFA)。
(三) 测定步骤
1. 试液溶液的制备 准确称取粉碎粒径在0.5mm以下均匀试样1g, 放入50ml具塞玻璃离心沉降管中, 加正己烷10ml, 充分振摇后离心分离, 用倾注法弃去正己烷层, 再重复一次。将试样中残存的正己烷蒸发除去。加入80%(V/V)乙醇10ml, 并放沸石, 装好冷凝管在水浴上回流30min, 离心分离将乙醇层倾入200ml容量瓶中, 残渣再用80%乙醇10ml,充分混匀, 离心分离, 乙醇层并入200ml容量瓶中(反复操作3～4次)。以80%乙醇稀释定容至200ml, 取此液10ml浓缩至干, 作TMS化试样。
2 色谱条件 柱子: 2% Silicone OV-17, Chromosorb W(AW, DMCS 60～80目, 3mm×0.5m, 不锈钢柱;;柱温: 120～340℃(升温);升温速度: 10℃/min; 进样口检测器温度: 350℃;氮气流量: 60ml/min;FID, 氢气流量: 50ml/min; FID, 空气流量, 1L/min;
3. TMS衍生物的制备 取TMS化试样, 加入内标物芘的吡啶溶液(40mg/50ml)500μl, 再加HMDS 0.45ml、TFA 0.05ml, 加塞充分振摇混匀, 使糖溶解, 在室温下放置15～60分钟, 即为TMS衍生物溶液。注入1μl, 进行GC分析。
4. 标准曲线制备 用蔗糖、棉子糖、水苏糖等标准糖(70℃下减压干燥)制备1mg/ml标准液。取适量标准溶液(每种糖含量0～3mg), 置于磨口容器内, 冷冻干燥 。采用2法操作、制备标准糖的TMS衍生物溶液。注入1μl按色谱条件进行GC分析。从得到的色谱图计算糖和内标物的面积。设X为重量比(TMS衍生物溶液中糖的mg量/TMS衍生物中内标物mg量)Y为面积比(糖的峰面积/内标物峰面积), 根据*小2乘法求回归直线即为工作曲线。
(四) 结果计算 首先求出样品GC色谱图上各种糖的峰面积与内标物峰面积之比, 然后再从标准糖制成的工作曲线上查出样品中的各种糖含量
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